因調控是生命科學研究的重要領域，深入了解基因間的相互作用及其調控機制對于揭示生物的發(fā)育、疾病發(fā)生機制至關重要。3C（Chromosome Conformation Capture）是一種重要的染色體構象捕獲技術，它被廣泛應用于研究基因組中染色體的三維結構和基因調控網絡。通過3C技術，我們可以捕獲并分析染色體上不同區(qū)域之間的物理相互作用，從而了解基因組的空間結構和基因調控的機制。
一、3C及其衍生技術的介紹
基于3C技術發(fā)展出了多種衍生技術，如4C-seq、5C、Hi-C、ChIA-PET等，這些技術在揭示基因組的三維結構和基因調控中發(fā)揮著重要作用。4C-seq和Hi-C作為兩個重要的3C技術衍生方法，通過分析染色體的三維結構與基因間相互作用，為我們提供了更加全面和精細的基因調控信息。
3C 及其衍生技術
二、4C-seq技術介紹
4C-seq（Circular Chromosome Conformation Capture Sequencing）是在3C技術的基礎上發(fā)展而來的中高通量測序技術，通過選擇特定區(qū)域（增強子、沉默子、啟動子、功能性SNP位點、基因編輯位點、差異甲基化區(qū)域、染色質開放區(qū)域）作為錨點（bait,viewpoint）捕獲并測定其與整個基因組中其他片段之間的相互作用。
4C-seq實驗原理
甲醛交聯固定染色質構象、主限制性內切酶（RE1）酶切、連接、解交聯、純化后得到雜交片段（3C模板）
通過次限制性內切酶（RE2）對3C模板進行二輪酶切、連接后得到環(huán)化4C模板
使用兩步法PCR建庫，使用特殊設計的引物對環(huán)化產物進行反向PCR，進行第二輪PCR制備4C-seq文庫，并進行NGS測序。
4C-seq實驗原理圖
三、4C-seq與其他技術的比較
- 3C-seq可以測得兩個特定靶點的互作，實驗相對簡單。4C-seq可以測定一個靶點區(qū)域與整個基因組的互作，實驗相對復雜。
- 對于不明確的靶點關系，3C-seq可能會受限。例如，增強子/沉默子的直接靶標不一定是最近的基因啟動子。
- 在基因表達調控中，增強子/沉默子區(qū)域通常與多個靶基因的啟動子區(qū)域相互作用形成調控簇，例如超級增強子。這種調控關系4C-seq可以更好的揭示。
2.與Hi-C相比
四、4C-seq應用范圍
4C-seq可用于研究基因組組織的多個方面
- 識別調控性染色質環(huán)：通過4C-seq技術，可以確定基因座與調控元件（如增強子和啟動子）之間的物理相互作用，揭示基因調控網絡中的關鍵調控因子和機制。這些調控性染色質環(huán)對基因表達的調控起著重要作用。
- 識別結構性染色質環(huán)：4C-seq可以幫助識別結構性染色質環(huán)，如由cohesin和CTCF調控的TAD邊界形成的染色質環(huán)。這些結構性染色質環(huán)在維持染色體三維結構和基因組穩(wěn)定性方面起著重要作用。
- 4C-seq可以輔助HiC解析局部TAD結構并揭示順式調控元件的調控范圍。例如，解析neo-TAD的形成以及疾病中的增強子劫持現象。
- 揭示基因表達調控簇：通過對具有相似染色質特性的基因組區(qū)域進行聚類分析，可以揭示基因表達調控簇。例如，可以識別超級增強子，這些區(qū)域在基因表達調控中起著關鍵的作用。
綜上所述，通過4C-seq可以揭示特定區(qū)域與整個基因組之間的空間相互作用，進一步了解基因調控網絡、基因組結構和功能的變化，以及染色體異常對細胞和個體的影響。4C-seq在基因調控研究、基因組重塑研究、染色體斷裂和重排研究以及疾病研究等領域具有廣泛的應用價值。
Cova G et al. Combinatorial effects on gene expression at the Lbx1/Fgf8 locus resolve split-hand/foot malformation type 3. Nat Commun. 2023 Mar 17;14(1):1475.
SHFM3是一種與Lbx1/Fgf8位點重復相關的先天性肢體畸形疾病。通過在轉基因小鼠中研究SHFM3相關重排對染色質結構和基因表達的影響，發(fā)現Lbx1/Fgf8位點包含兩個相互作用的調控區(qū)域。重排導致染色質結構的重組，并在頂端外胚層嵴（AER）中以類似Fgf8的模式異?；罨疞bx1和Btrc基因。這些發(fā)現揭示了SHFM3的分子機制，并為基因組重排導致基因異常表達和疾病提供了框架。
通過對SHFM3 Dup患者和健康人進行4C-seq實驗，與健康對照相比，檢測到含有AER增強子的FGF8所在的TAD 125kb區(qū)域與LBX1和BTRC基因之間的互作特異性增加。并且通過對Dup和Inv類型小鼠的cHiC virtual-4C進一步驗證了該結論。
Luan J et al. CTCF blocks antisense transcription initiation at divergent promoters. Nat Struct Mol Biol. 2022 Nov
本文通過基因編輯、染色質構象研究、高分辨率轉錄圖譜等方法，揭示了精準定位的CTCF直接抑制上游反義轉錄本（uasTrx）的啟動來塑造轉錄過程，而這種抑制與其結構功能無關。
本文研究了CTCF對非編碼轉錄本的影響，通過PRO-seq、CTCF ChIP-seq等實驗發(fā)現CTCF耗竭后導致不同啟動子的uasTrx表達廣泛上調。為了驗證這種效應是否與CTCF和cohesion形成的loop、TAD結構有關，通過基因組編輯技術分別刪除TSS近端CBS（CTCF結合位點）、遠端loop錨點后通過4C-seq驗證了CTCF對近端uasTrx的抑制作用獨立于其三維結構功能。
Huang Z et al. The corepressors GPS2 and SMRT control enhancer and silencer remodeling via eRNA transcription during inflammatory activation of macrophages. Mol Cell. 2021 Mar 4 本文通過研究小鼠Ccl2位點的染色質結構、組蛋白修飾、轉錄因子和共調節(jié)因子動態(tài)以及eRNA轉錄，解釋了核心抑制因子在控制與炎癥基因表達相關的增強子和沉默子重塑中的作用。 通過4C-seq分析了Ccl2位點3D染色質結構和增強子/沉默子-啟動子互作，解析了LPS激活免疫、核心抑制因子GPS2和SMRT的耗竭誘導了增強子-啟動子loop的形成。
Dos Santos M et al. A fast Myosin super enhancer dictates muscle fiber phenotype through competitive interactions with Myosin genes. Nat Commun. 2022 Feb 24
成人肌纖維的收縮特性是由其肌球蛋白重鏈亞型的含量決定的。本文通過Chip-seqsnATAC-seq在重組快速肌球蛋白基因位點鑒定了一個超級增強子，并通過4C-seq鑒定了活躍的快速肌球蛋白啟動子-超級增強子loop結構。再通過CRISPR/Cas9編輯技術，證明了該超級增強子在控制快速肌球蛋白基因中的重要作用，并揭示了啟動子對共享超級增強子的積極競爭。
4C-seq比較了股四頭肌（Fast Quadriceps）和比目魚?。⊿low Soleus）在Myh4和Myh2啟動子與超級增強子互作的差異性，反應了不同類型肌球蛋白Myh基因家族表達的特異性。
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